中医诊断疾病的基本原理大全11篇

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[中图分类号] G424 [文献标识码] C [文章编号] 1673-7210（2013）05（a）-0135-02

随着社会的发展，高等医学教育从重视理论教学、轻视实践教学逐渐发展到重视学生实践能力培养的教学，云南中医学院（以下简称“我院”）提出了“培养实用型中医药人才”的培养目标，为了达到学校的培养目标，我们制订了影像诊断学的教学目标为：打牢基础，掌握常见疾病的影像学诊断及鉴别诊断，掌握常用影像学检查方法的选择，了解影像学在中医临床及研究中的应用。为了达到教学目标，我们在教学中采用了理论联系实际的教学法――典型病例教学法，取得了一定的教学效果，为了进一步提高教学效果，解决典型病例教学中存在的问题，我们将比较影像学的方法引入教学中。

比较影像学是影像学的一个分支，根据对照比较的指导思想和方法去研究和探索各种成像技术的要素和基本原理，目的一是为了更准确地诊断和鉴别疾病，二是为了更合理地选择影像检查方法[1]。为了提高影像学的教学质量，比较影像学已被部分医学院校引入到教学中。

1 中医院校影像诊断学典型病例教学法现状

典型病例教学法是通过对典型病例进行分析推理和判断，来学习医学知识的一种方法 ，是一种理论联系实际的教学方法[2]。典型病例教学法在教学中有利于激发学生学习兴趣和创造能力、能有效地发挥学生的主体作用、有利于培养学生创新能力和解决问题能力[3]。但在我校的教学中，除了有以上优点外，也存在一些问题：①课时少，教学内容多。②学生的解剖学、生理学、病理学等西医基础薄弱。③如何在教学中将影像诊断学的内容与中医的相关知识有机地结合在一起。以上情况造成学生对影像学相关内容不理解，对疾病的诊断、鉴别诊断及对检查方法选择无从下手，对影像诊断学与中医的结合难以理解，因此在教学中必须转变观念 ，授课过程中放弃按部就班， 进行各种图像间的比较及各种检查方法的对比[4-5]；为了使学生理解影像诊断学与中医的相关知识的结合，将影像诊断学中的西医内容及影像诊断学与中医相结合的内容与对比的方式进行讲解，这对提高中医院校影像诊断学教学效果及中医学生的临床技能非常重要。

2 比较影像学在典型病例教学中的应用

2.1比较影像学有助于提高学生对影像诊断学理论的学习

对于学生而言，影像诊断学理论既抽象又难于理解，为了解决学生的困难，我们用比较的方式对相关内容进行讲解，引导学生思考及理解相关内容；例如：各种成像技术的基本原理及应用的内容抽象不易理解及记忆，因此在教学中采用对照比较的方法进行讲解，强调每种检查方法的优点、缺点、成像特点及他们之间的相辅相成、互为补充和相互印证的关系；同时应用典型病例引导学生思考临床上应如何选择合理的检查方式，这样就既加深了学生对影像学检查方法的理解，同时也培养了学生的临床能力。

2.2 有助于学生对疾病的诊断及鉴别诊断

影像诊断学的教学内容中涉及大量疾病的影像学表现，疾病的影像学表现有“异病同影，同病异影”的特点，这让学生在学习中感到异常困难，在阅片时不知如何得出诊断结论[6]，因此在教学中，应用比较影像学的方法将影像学表现有相似之处的不同疾病的图像进行比较，列出它们的相同点、不同点，同时指出每个疾病的特征性表现，引导学生分析问题、解决问题，使学生对相关内容加深印象，同时掌握通过分析图像得出诊断的方法。例如：在讲解中央型肺癌时，将周围型肺癌、肺错构瘤、转移性肺癌等有肺部占位性表现的疾病的图像列出，通过比较，找出它们影像学表现的相同点及不同点，同时指出它们各自的特点：中央型肺癌，肿块靠近肺门；周围性肺癌；肿块边界有毛刺，可出现空洞；肺错构瘤可出现爆米花的钙化；转移性肺癌肺部可见多个病灶。通过比较讲解后，学生对中央型肺癌的影像表现印象深刻，同时学习了其他疾病的影像学表现，扩宽了知识面，了解分析影像表现的方法及鉴别诊断的方法。

2.3有助于学生对影像学诊断方法的选择

现在，在临床工作中，对影像学诊断方法的选择，常遵循以下原则：①有利于患者疾病的诊断及指导治疗[7]。②尽量避免对患者的机体造成不必要的伤害[8]。③避免重复检查。④经济的原则，这就要求学生掌握不同检查方法的优缺点、同一个疾病在不同检查法中的表现特点及局限性[4]。为了解决这个问题，在教学中，强调不同的影像学检查方法的优点及缺点，同时结合疾病进行讲解，培养学生合理选择相关疾病的影像学检查方法的能力[9]。例如：脊柱椎体的爆裂性骨折，患者有外伤史、体征为脊柱的部分节段触诊有压痛等，脊柱正、侧位片上，有时骨折线显示不清，仅表现出椎体形态不自然，而且不能显示是否有骨片落入椎管，为了进一步明确脊柱损伤的情况，就需要进行CT检查，CT能显示相应的节段的脊柱椎体是否有骨折表现且骨折片是否落入椎管，但CT不能很好地显示脊髓损伤的情况，为进一步了解脊髓损伤的程度，需行MRI检查。这样讲解了以后，学生就会明白平片常常不能清晰显示脊柱骨折，CT能清晰地显示脊柱是否骨折，但不能很好地显示脊髓损伤的情况，MRI检查可以很好显示脊髓损伤的情况。所以在工作中就可以根据疾病在不同的影像学检查中的表现的特点，根据临床需要选择不同的方法，达到辅助临床诊断、指导治疗的目的。

2.4有助于学生对影像诊断学与中医相结合部分的理解。

中医院校的影像诊断学教学中涉及影像诊断学与中医相结合的内容，包括影像诊断学应用于中医研究的领域、在中医临床中的应用以及中医相关技术在影像诊断学的应用，这些内容是学生较感兴趣但又觉得不易理解的部分[10-11]，我们就将这部分内容用对比的方式与西医的相关内容一起讲解，促进学生对相关知识的理解。例如：慢性支气管炎的影像学表现为肺纹理增粗、增多、扭曲、紊乱，伴有肺气肿可出现肺野透亮度增高、膈肌低平等[12]；肺气虚型的患者出现肺纹理稍增多、增粗，增多的肺纹理多呈条索状，走向规律，肺气肿征象少见，寒痰型仅见肺纹理略增粗[5]经过讲解后，学生不仅了解慢性支气管炎的影像学表现，同时还了解了影像学可用于中医相关症侯的诊断及了解相关症候的影像学表现。

3 应用后的教学效果

将比较影像学的理念引入我院2009级中西医结合专业的影像诊断学典型病例教学中，用比较的方式对相关的内容进行讲解后，通过一年的教学，教学取得了良好的教学效果，学生对此也有很好的评价。我们对相关专业的学生进行了调查： 96.7%的学生认为这种教学方式对理解疾病的影像学表现、对了解各种检查方式的优缺点、对今后的临床工作有帮助，100%的学生认为对学习影像诊断学理论有帮助。

4 展望

有学者提出在医学影像学迅速发展和医疗费用日见增长的今天， 尤其是在像中国这样的发展中国家，人民生活水平还不太高、医疗资源还不太丰富的情况下，发展比较影像学势在必行[13-14]。为了让学生适应今后的临床工作，了解一些新观念，掌握基本的临床技能是必要的，因此在我院西医课程的教学中，尤其强调加强学生对西医基础知识的掌握及对学生相关临床技能的培养， 因此我们在影像学诊断的典型病例教学当中，应用比较影像学的方法进行教学，并取得了良好的教学效果。但在教学中也存在一些问题，如进行比较的内容太多，比较的方法不恰当，学生反而容易糊涂，因此我们在教学中要不断地总结，结合教学实际，让比较影像学的方法在教学中发挥其优势，提高教学质量。

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[12] 王叙馥，左书耀，张勤.比较影像在核医学教学中的应用[J].中国高等医学教育，2006，2：82-83.

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    辨证论治是中医学诊断病症的主要方法,而证候的表述往往是定性和描述性的,诊断标准不容易把握。医学和数学工作者将数学方法应用于具体的病例分析中,实践表明中医学的证候规范化、标准化是可行的,量化研究是中医证候范化和发展中医学科的必经途径[10-11]。运用模糊数学来量化中医证候和诊断的过程模糊数学是利用模糊集合、隶属函数和模糊算子来描述集合内部元素的不确定性。中医学的理论类属、脏腑形态结构与功能活动、临床症状性态、证候质量互变等方面存在着模糊性,模糊数学的出现使得这类概念的量化成为可能,其诊断过程与中医专家的思考过程具有一定的相似之处[12]。周慧生[13]运用模糊数学对中医症状诊断进行量化表述,构建了模糊诊断模型总框架,并利用计算机进行中医模糊诊断。刘兰林[14]等利用隶属度和隶属函数对数脉的模糊特性进行适当的描述,并转换成计算机能够处理的基本信息,在一定程度上揭示了数脉的本质。陈荣山等[15]应用模糊聚类法分析了不同时间脉搏振幅函数各特征点的坐标,借助向量余弦法列出判别公式,建立脉搏振幅的余弦函数,结合已有的疾病数据库来自动诊断疾病,准确率可达85%。谢杰[16]运用模糊数学多层次综合评判法和模糊模式识别技术进行绝经后骨质疏松症(PMOP)的证型研究,构建了辨证分型(PMOP)的数学量化模型。运用多元分析法来对中医证候、诊断、辨证论治规范化、标准化、客观化多元分析方法是定量分析事物间复杂相互关系的一种数理统计方法,通过评估各症状、体征、实验室指征对中医辨证诊断的价值,逐步筛选出诊断意义较大的指标进行量化,并计算其发生概率,然后依据概率的大小来进行证候诊断和鉴别诊断,进而判断病情的发展趋势,评价治疗效果,做出预后诊断。周慎[17]等利用逐步Bayesian判别法建立了各症状中风后遗症症状因子的判别函数和各证候的判别方程式,并分析了其前瞻性判别概率,有较好的参考和实用价值。李宗信[18]等运用主成分分析法对慢性疲劳综合征(CFS)气虚证和血虚证患者进行分析,结果表明提取出的气虚证和血虚证症状的主成分,能够基本准确地反映患者的实际证候,在临床实际中将两者结合能够简化诊断程序,提高辨证的客观性和准确性。陈文锋[19]等应用探索性因子分析法对广州地区处于亚健康大学生中医问诊指标、舌诊和脉象指标进行统计分析,将中医证候分为气滞血瘀证、肝气郁结证、湿热证、阳虚证、气血亏虚证、阴虚证分为6类。王阶等[20-21]采用逐步回归法和Logistic回归对冠心病和心绞痛病人多项生理指标进行统计分析,确认全血粘度、总胆固醇等5个因素对冠心病血瘀证的贡献最大,并总结这两种病的主要证候要素和病机变化规律。

    数学方法在中药研究中的应用

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[中图分类号] G642.0 [文献标识码] C [文章编号] 1673-7210（2012）08（b）-0155-02

Exploration on combined model of situational teaching and case discussion in clinical probation teaching of TCM gynecology

GAO Jie LUO Songping DENG Gaopi LIANG Jing

Staff Room of Gynecology, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Province, Guangzhou 510405, China

[Abstract] Clinical probation teaching of TCM gynecology is the bridge stage of students walking from gynecology classroom instruction to clinical practice. Because of subject characteristics of strong practicality of TCM gynecology, it pays more attention to the exercise of clinical diagnosis and treatment thinking ability of students and cultivating the ability of communicating with patients as soon as possible. Bringing the combined model of situational teaching and case discussion into clinical probation teaching of TCM gynecology, it not only arouses the enthusiasm and autonomy of students, enchances the responsibility of students as doctors, but also enchances the humanistic care for patients and the ability of dealing with doctor-patient relationship, achieving better teaching effects.

[Key words] Situational teaching; Case discussion; TCM gynecology; Clinical teaching

临床见习是每个医学生从课堂学习走向临床实践的桥梁，是临床诊疗思维形成的重要阶段，也是医德素质教育和处理医患沟通的启蒙阶段，所以临床参观见习对未进入临床的医学生来说至关重要[1]。中医妇科学是中医临床医学的重要组成部分，是高等中医药院校主干课程之一，由于其具有实践性强、操作性高的学科特点，且妇科疾患多涉及患者及其家庭生活的隐私，所以中医妇科学的教学见习带教不仅仅让医学生掌握常见妇科病的定义，对其诊断、治疗有初步地认识，更重要的是要培养学生的临床应对能力和思维能力，让学生能更好地将课堂教学知识与临床实践相结合，具备一定的临床分析能力。

情景再现模式，是将患者疾病发生或者医患交流的过程情景再现在讨论会或者课堂中，使得扮演患者和医生的同学能够有身临其境的体会。通常情景再现模式，用于课堂演示教学，调动学生积极性，激发学习气氛。

案例教学法（case teaching method，CTM）就是在教师的指导下，根据教学目的的要求，组织学生通过对案例的调查、阅读、思考、分析、讨论和交流等活动，教给他们分析问题和解决问题的方法或道理，进而提高他们分析问题和解决问题的能力，加深他们对基本原理和概念的理解的一种特定的教学方[2]。

传统的临床见习带教，老师带领学生在床边问诊、查体，讨论，课前学生的自主性、积极性不够，不能形成较好的师生配合；另外对特殊妇科疾病的床边查房，尤其是患者情绪容易紧张或者家属避忌的疾病尤其不适宜。临床见习不能达到理想的教学效果，学生易逃避见习课程，学习效果不佳。

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【关键词】 中医学； 辨证施治； 群组决策； 信息熵； 灰色关联； 乙型肝炎

中医学的整体观念［1］，强调机体内外环境的统一性，是从整体上把握疾病的变化特点及其规律的系统医学，在把人体的看成一个有机整体的同时，将患者所处的生活环境、地理位置等外界因素综合起来进行临床诊治。实践证明，诸如环境、地理、季节这些外界的客观因素都会对疾病的发生、演化、发展产生一定的影响。例如：陈国林［2］等曾调查了中医肝脏证候的分布规律，分析了证候与南北地域和季节的关系，发现肝阴虚证、肝火上炎证以及肝胆湿热证多见于南方；肝血瘀滞证多见于北方；肝阳上亢证与季节有关。中医学认为“六气”，即风、寒、暑、湿、燥、火的不断运动变化，决定了一年四季气候的不同。人体由于某种原因而导致抵抗力下降（正气虚），不能够适应季候变化，或者季候的变化异常超过了人体的适应能力时，六气就成为致病的条件，这时的六气被称为“六”。正是因为四时的变化影响着人体的生理功能与病理变化，故《素问·五常政大论》认为，“圣人治病，必知天之阴阳，四时之经纪”。不仅如此，人体自身性格、饮食习惯、年龄大小等因素也对疾病的产生、发展有实际的影响。

既然，诸如这些非直接致病外界因素是确实对疾病的有一定作用和影响；那么，在中医临床诊断上就有必要了解这些因素对疾病影响程度的大小，从中寻找一定的规律，建立相应的中医学辅助诊断数据库，为临床实践提供参考和帮助是十分有意义的。因此，如何对这些直接致病因素进行分析、评价和排序是首先需要明确的问题。本研究就此类问题给出研究思路与具体分析方法。

1 评价对象与指标体系研究

中医诊断学［3］中的“辨证施治”是通过望、闻、问、切的“四诊合参”全面地收集患者的临床信息，对疾病过程中机体某一阶段的病因、病位以及病机等整体病理状态进行综合分析。例如，乙型肝炎中医临床指标中，由“问诊”和“望诊”可以判断：头痛、肢体麻木、肢体困重、关节疼痛等症状、体征的变化；由“舌诊”可以得到：舌干、边齿痕、舌下脉络增粗、苔黄等；由“切诊”可以判断：脉沉、脉数、脉滑等变化。中医专家通过对这些指标信息的收集，结合中医“辨证施治”的基本原理进行诊断，即：对病人的症状、体症等进行分析、综合，并对疾病当前阶段的病因病性等做出判断，并概括为完整证名的诊断过程。例如，在乙型肝炎中的中医“证候”主要有：湿热中阻证、肝肾阴虚证、肝郁脾虚证、脾肾阳虚证、瘀血阻络证五种“证型”。因此，“辨证施治”是中医学的主要方法，而对“证型”的研究则是中医学的核心前提。所以，在对影响疾病客观性因素的评价中，也应该首先以“证型”作为主要研究和评价的对象，即从各种不同的“证型”出发来研究其他客观性因素对疾病的影响。

因此，如何对这些因素进行有效的判断、评价和排序是关键问题，而多属性评价方法具有操作简单、条理清晰、可靠性高等优点，无疑是解决此类问题比较理想的方法之一。以下我们将根据中医学的特点，尝试综合利用多属性评价方法提出解决办法。

2 基本方法

2.1 评价的基本思路

中医学多属性评价基本方法和其他决策问题的评价过程与方法大致相似，不过在中医学决策评价中应该更注重属性指标的选取，建立准确的决策矩阵是评价的前提，以下给出决策评价的基本思路：

① 根据所要研究的问题确定评价对象与评价指标。评价对象在中医学研究中可以是与各个证候、症状、体征有发生、演化有密切关联的诸如环境、地理、季节、气候这些外界的客观因素以及其他非直接致病因素等等；评价指标可以是症状、体征等临床表现的量化指标；例如，要研究季节气候变化与症状、体征的关系，可以将不同季节气候作为评价对象，把症状、体征发生的频率、次数等作为评价指标值，以此来建立评价决策矩阵；

② 对已建立的初始决策矩阵进行规范化等预处理；

③ 根据专家们的评分结果，根据特征法计算群组权重；然后，计算出客观权重；最后，将主客权重进行组合，得出最终权重；

④ 根据权重，得出各个评价对象的综合指标值；在计算综合指标值时，可以直接进行计算；有时，可以假定存在一个“理想指标序列”，而采用“理想关联度法”处理，最后根据综合值大小进行排序。

2.2 计算过程

在此我们给出了一个具体计算的评价模型，当然也可以根据实际情况选用其他方法，一般处理步骤如下：

① 确定评价矩阵

假设在某种疾病中医临床某一确定证型下，有m 个评价对象，则评价项集合可以表示为记为X={x1，x2，…，xm} ；用Yi={yi1，yi2，…，yim} 表示与该种证型有关的n 个属性值；确定的方法可以根据中医学专家的意见或诊断标准为参考。其中，yij 是第 i个评价项的第j 个属性的值，列成评价矩阵，如表1所示；表1 评价矩阵

y1 … yj … yn

x1 y11

… y1j

… y1n

… … … … … …

xi yi1

… yij

… yin

… … … … … …

xm ym1

… ymj

… ymn

并且选择采用下式之一进行变换：

zij=yij maxj(yij) （1）

zij=minj(yij) yij （2）

② 权重确定

将指标模糊定量化为相应的评分，分为5个等级，评分结果为：重要（5分）、比较重要（4分）、一般重要（3分）、次要（2分）、不重要（1分）。请 m个中医专家对 n个指标的权重进行评分，得到Fuzzy判断矩阵：

X=x11 x12 … x1n

x21 x22 … x2n

… … … …

xm1 xm2 … xmn

采用特征根法［4］求出理想（最优）专家S* 的评分向量为：X*=(x*1，x*2，…，x*n) ，然后进行归一化处理：

λi=x*i n i=1x*i （3）

再采用信息熵权方法［5］计算客观权重：

hj=-(lnn)-1m i=1zijlnzij （4）

wj=1-hj n j=1(1-hj) （5）

最后，由式得到最终权重向量：

ηj=λj wj n j=1λj wj) （6）

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③ 关联度计算

构建一个能充分满足诊断思想和疾病特征的理想属性指标序列，采用下式进行关联［6］计算：

γik(x0(k)，xi(k))=

mini mink|b0(k)-bi(k)|+ρmaximaxk|b0(k)-bi(k)| |b0(k)-bi(k)|+ρmaximaxk|b0(k)-bi(k)| （7）

其中，γi=(γi1，γi2，…，γim) ，b0=(b0(1)，b0(2)，…，b0(k)) 为标准的效果评价向量，bi=(bi(1)，bi(2)，…，bi(k)) 为第i 个评价向量。

④ 评价排序

设I 为评价项与理想属性指标属性的广义Hamming距离，则有优选模型：

ui=1 1+(1-Ii Ii)2=1 1+(1-n j=1ηj γij n j=1ηj γij)2 （8）

式中，ui 为属性相对于理想属性的优属度；ηj 为综合权重；根据ui 的大小就可以对评价项进行排序。

3 实例应用

中医诊断中通常将乙型肝炎分为湿热中阻证、肝郁脾虚证等5种证型进行治疗。根据中国中医药学会内科肝病专业委员会［7］1992年推出的《病毒性肝炎中医辨证标准（试行）》可知，乙型肝炎中医“肝郁脾虚证”临床表现有：胁肋疼痛、太息、胸闷、口淡、腹胀、烦躁易怒、面色萎黄、边齿痕、苔白、便溏、倦怠乏力、食欲不振等12种症状、体征。在乙型肝炎患者中如果出现肝郁脾虚证的情况下，是否与该地区的季节气候有关或在什么季节中出现肝郁脾虚证的可能性较大目前尚不清楚，阐明季节气候对中医证候的影响，对中医学临床证候的评价具有重要参考意义。利用本节所提出的综合评价方法就可以有效地解决该类问题。

我们根据从2004年12月~2005年12月之间在上海中医药大学附属曙光医院采集的871例确诊为乙型肝炎患者的临床数据为基础，结合本地区（上海）季节气候变化特点，并根据《病毒性肝炎中医辨证标准（试行）》的和乙肝患者临床数据资料所调查记录的时间进行归类。按不同的季节气候分为5组（1月份、3~4月份、8月份、9~10月份、11~12月份）进行评价，分别统计各个症状、体征在不同时间段内出现的频率（百分比）作为属性值，得到评价矩阵，如表2所示。

请6位中医学专家对“肝郁脾虚证”各个症状、体征的权重进行模糊评价打分，如表3所示。

将初始评价矩阵，根据效益型数据处理，化为列归一化矩阵；然后，利用式子计算得到客观权重向量w=(w1，w2，…，w12) ；最后，结合专家主观权重结果和式得到综合权重向量η=(η1，η2，…，η12)。如表4所示。 表2 初始评价矩阵表3 专家权重评定表4 专家权重、熵权重以及综合权重

一般地，可以继续构建一个能充分满足诊断思想和疾病特征的理想属性指标序列b0 ，其基本思路是：如果与“肝郁脾虚证”有关的所有症状、体征都发生的情况下，即发生频率为100%时，基本上就能够断定为该种“证型”。所以，在这里我们就将b0=（100，100，…，100) 为作为基准序列，按照式（6）计算各个关联系数γij ，得到关联系数矩阵γ ：

γ=0.5324 0.6686 0.6534 0.6115 0.5389 0.9074 0.8533 0.8622 0.5492 0.6686 0.5492 0.7183

0.5421 0.6350 0.6323 0.5778 0.5339 0.8652 0.8504 0.7663 0.5401 0.6878 0.5401 0.6499

0.5122 0.5301 0.5444 0.5468 0.5417 0.9713 0.7449 0.7353 0.5591 0.6488 0.5278 0.8986

0.5444 0.6350 0.6212 0.7232 0.5954 1.000 0.8150 0.8389 0.5716 0.6080 0.5497 0.7933

0.5176 0.5513 0.5707 0.5617 0.5738 0.9539 0.7933 0.7993 0.5468 0.6698 0.5468 0.9019

再由关联系数矩阵γ 并根据式（8）可以得到各个评价对象的优属度值：表 5 优属度结果表 由此优属度值可知：u1>u5>u2>u3>u4 ，即乙型肝炎中医“肝郁脾虚证”在寒冬入秋季节发生的可能性最大，其次为初冬、春季，而夏季、初秋时则相对比较少见。通过排序我们就可以认为冬季以及气温较低的季节对乙型肝炎中医“肝郁脾虚证”的发生作用影响较为显著，因此，在中医学临床诊断中应该给予重视。

不仅如此，由多属性评价方法得到的结论还可以进行模糊化处理以方便今后用于中医专家系统的辅助诊断参考数据。例如，根据上面的评价结果，我们就可以将在乙型肝炎中医"肝郁脾虚证"中各种季节气候进行适当的模糊隶属度确定，并将其放入综合数据库。表6 模糊隶属度

4 小结

本研究提出了利用综合多属性评价方法解决中医学临床诊断中的非直接致病因素对疾病影响的排序问题。给出具体实际算例子：以中医诊断学“辨证”方法为基础，提出利用模糊评价和群组决策特征整合中医学专家组的意见，避免了传统层次分析法中两两对比构造判断矩阵易于发生目标先后不一致性；同时，引入熵权来确定各个评价指标的综合权重，减少评价中认为的主观因素，为中医学临床诊断研究提供一定参考。当然，中医学以及中医临床诊断学［8］都具有复杂性、整体性、非线性、动态性等特点，因此如何更一进挖掘临床症候与各种内部、外部因素的关联性，还需要不断地探索和研究。

（致谢：本文完成过程中得到上海中医药大学刑陈军老师、王弈老师以及上海中医药大学附属曙光医院等中医专家的帮助，在此深表谢意。）

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5 徐泽水.不确定多属性决策方法及应用.北京: 清华大学出版社， 2004， 26~27.

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近年来,中医药作为一种重要辅助及补充医学,在逐步走向世界的同时也受到一些质疑。其主要原因之一是以目前现代科学研究方法难以提供足够的证据支持包括传统针灸经络理论在内的中医药理论。因此,在一定程度上成为限制中医药发展的瓶颈问题。随着计算机技术、医学影像技术及图像处理技术的发展,新技术在中医药基础及临床科研中的应用越来越广泛,推动了中医药科学的现代化发展。作为一种先进的生物医学影像技术,fMRI在探索中医药在临床疾病治疗中的作用机制方面展现了非常重要的潜在应用价值,但fMRI技术的复杂性要求从事该项研究的人员同时具备计算机信息科学及医药学基础知识,而我国传统医工分离的教育体制导致该领域人才匮乏。近年来,为实现中医药现代化和信息化目标,全国不少中医药院校逐步开设了中医药信息学专业。作为一门新兴的医工结合的交叉学科,中医药信息学将现代信息工程技术与传统的中医药科学密切关联,为培养符合中医药领域fMRI研究人才创造了条件。笔者认为,推动中医药信息学科建设、开展中医药领域fMRI研究,是利用现代科学技术和科研方法挖掘中医药宝库、研究中医药科学、解决制约传统医学发展瓶颈问题的关键所在。

2磁共振功能成像基本原理及其在科研中的应用

传统医学成像技术主要包括X线成像、超声成像、电子计算机X射线断层扫描技术(CT成像)、磁共振成像(MRI)及核医学成像,以往这些成像均以解剖成像为主,主要通过观察疾病引起的解剖形态变化来实现诊断和鉴别诊断目的。随着计算机技术的发展,医学影像技术逐步从之前单一解剖成像发展成为一种解剖成像与功能成像兼备的可用于临床疾病诊断治疗及基础和临床科研的技术手段,其中MRI技术的发展尤为突出。fMRI便是一种将功能与解剖成像、临床与科研影像相结合的成像新技术,为脑功能相关的基础和临床研究开拓了新的发展方向。

2.1基本原理

广义的fMRI技术包括弥散加权成像(DWI)、弥散张量成像(DTI)、灌注加权成像(PWI)、磁共振波谱分析(MRS)、磁共振波谱成像(MRSI)及血氧水平依赖成像(BOLD)等。不同的成像技术各有优势,在临床中有不同的应用。狭义的fMRI一般特指基于血氧水平信号变化强度的BOLD技术,其基本原理是人体大脑神经元活动导致大脑被激活的功能区局部血流动力学发生改变,引起血液中顺磁性氧合血红蛋白及抗磁性脱氧血红蛋白的比例改变,使局部磁场均匀度变化,进而引起BOLD信号改变。

2.2基础及临床研究中的应用

基于BOLD的fMRI技术无需注射对比剂,以其无创、无辐射损伤、高空间和时间分辨率、可在活体上重复进行等优点在脑功能基础及临床研究中具备独特的优势。目前,fMRI在基础科研中主要应用于运动、感觉(听觉、视觉、嗅觉)、语言、认知、记忆、智力、情绪、性格、决策、睡眠、意识、性别、发育、衰老、针刺、坐禅、睡眠等相关研究,尤其在认知神经科学领域取得丰硕成果。在临床研究中,fMRI技术主要应用于神经系统相关类疾病、各种成瘾性疾病、精神类疾病、药物应用、脑卒中及损伤后神经功能恢复、疼痛及癫痫等相关研究。值得关注的是,fMRI能从整体上探索各种诊疗方案对人体中枢神经系统的影响,恰好与中医将人体视为有机统一整体的理念相符。因此,fMRI在各种中医特色病种的研究中独具优势,在揭示中医治疗疾病的内在机制方面有广阔的应用前景。

3磁共振功能成像在中医药领域中的应用

近年来,fMRI广泛应用于基础科研及临床研究中,在中医药领域,由于fMRI实现了无损伤活体脑功能研究,可直观获取针刺时脑功能区激活状态的信息,使针刺作用机制的研究日趋深入。目前,国内外学者做了大量基于fMRI的针刺作用机理研究[1-5]。其范围主要涵盖真针刺与假针刺时中枢神经响应的区别、不同针刺手法中枢神经响应的区别、不同穴位中枢神经响应的区别、健康志愿者与处于不同疾病状态下患者的区别、针刺刺激与其他类型刺激的神经响应区别等。针刺作用的发挥与中枢神经系统的调控及调节机制密切相关,但对针刺通过中枢神经系统调控的具体作用机制,目前仍存在不同的学术观点。如哈佛Martinos生物医学图像研究中心的中医针灸研究团队的研究表明,针刺是通过大脑边缘系统、旁边缘系统、大脑皮层的负激活来发挥作用[6]。国内相关研究则表明,针刺刺激具有不同的时空特性,这种不同穴位的不同时空特性正是针刺治疗的关键影响因素,也是针刺穴位特异性的基础[7]。当然,关于针刺fMRI研究的方法学尚存在一些问题[8],有待进一步深入探讨。另外,fMRI在中医药其他领域也逐渐显现了巨大的潜在应用价值。如在中医药治疗的疗效观察、疗效评价及作用机制等方面的研究正在逐步开展。此外,国内一些研究机构也在探索将fMRI用于中医症候及证型的研究中。

4对中医药信息学科建设的意义

fMRI作为在中医药基础研究及临床研究中有重要应用价值的现代化医学影像技术,对中医药的信息化和现代化发展起到极为重要的作用。当然,fMRI研究的复杂性对从事fMRI研究的科研人员提出了较大的挑战,fMRI复杂的实验数据处理要求相关科研人员既要拥有扎实的计算机科学、信息科学等理工学科知识基础,同时还要求具备必要的医学知识。因此,fMRI研究的发展需要一批具备跨学科专业知识的复合型人才,但我国目前医工分离的教育体制导致这一类型人才极为缺乏。为此,不少中医院校近年来逐步开设了中医药信息学专业课程。

作为一门新兴的中医药学和信息科学的交叉学科[9-10],中医药信息学科立足于中医药信息化发展的需要,将计算机科学、信息科学与医学科学相结合,打破了以往医工分离的教育体制,客观上提供了将包括中医药科学在内的医学和信息工程学科切实有效融合的客观条件,为fMRI研究发展所需人才的培养创造了条件。目前,不少中医药院校附属医院放射科室已引进了MRI,具备了开展fMRI研究所需的实验数据采集和分析的设备条件,同时又有充足的研究所需的病源条件,对今后开展中医药相关的fMRI研究极为有利。因此,中医院校有必要充分发挥中医药信息学科的重要作用,合理设置中医药信息学专业,调整中医药信息学课程设置,为学生构建医工结合的基础知识体系[11]；同时,重视培养开展fMRI研究所需的人才,推动fMRI研究在中医药领域的应用和发展,逐步形成fMRI研究发展与中医药信息学科建设互相促进的局面。

篇（6）

小儿泄泻是以大便次数增多，粪质稀薄，甚如水样为特征的一种儿童常见病。本病一年四季均可发生，其中冬春季节是小儿风寒泄泻的高发时段。泄泻病位在脾胃，主要的病理变化为脾的运化功能失常。正如《幼幼集成·泄泻证治》说：“夫泄泻之本，无不由于脾胃。”脾胃升降失司，精华糟粕不分，清浊合污下流，是形成泄泻的基本原理[1]。拔罐疗法是利用燃烧火焰的热力，排去空气，使罐内形成负压，使之吸附于腧穴或应拔部位的体表，而产生刺激，使局部皮肤充血、瘀血，以达到防治疾病的目的[2]，具有通经活络、行气活血、消肿止痛、祛风散寒等作用，可用于咳嗽、腹痛、腹泻、消化不良等疾病的治疗。笔者采用拨火罐治疗小儿风寒泄泻，收到较好的疗效，现将研究情况介绍如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 200910/201002广州市妇女儿童医疗中心中医门诊收治小儿风寒泄泻患儿40例，其中男26例，女14例;年龄最小8个月，最大3岁，平均1.8岁;

1.2 诊断标准 均符合西医小儿腹泻诊断标准[3]和中医小儿风寒泻诊断标准[4]。

1.3 纳入标准 (l)符合小儿腹泻中西医诊断及分型标准;(2)年龄≤3岁;(3)依从性好，患儿家长及监护人知情同意者。

1.4 排除标准 (l) 重症泄泻有脱水、酸碱平衡失调者;(2) 同时接受其他疗法，如补液、口服药物等。

1.5 治疗方法 取双侧天枢穴和中脘穴，选用1～3号玻璃罐，用棉枝蘸上酒精，将其点燃，在罐内绕一圈再抽出，迅速将罐子吸附在应拨部位上。拔罐时间：每次1～10 min，视患儿年龄大小而定。取罐时以食指压罐边皮肤，同时将罐向另一侧倾斜，使空气进入罐内。

1.6 疗效判定标准 参照《中医病症诊疗标准》[5]小儿泄泻疗效判定标准。(1)治愈：大便成形，全身症状消失，大便镜检无异常，病原学检查阴性;(2)好转：大便次数及水分减少，全身症状改善，大便镜检脂肪细胞或红、白细胞偶见;(3)未愈：大便次数及水分未改善或症状加重。

2 结果

40例患儿中痊愈15例，占37.5%，好转24例，占60%，未愈1例，占2.5%，总有效率97.5%。

3 讨论

泄泻是婴幼儿时期常见病，其病因可由感受外邪，内伤饮食，脾胃虚弱及脾胃虚寒等因素引起，其主要病位在脾胃。小儿脏腑娇嫩，形气未充，肌肤薄弱，脾常不足，冷暖不知自调，易受风寒之邪侵袭，与湿相搏，困于脾胃，导致运化失司，升降失常，清浊不分，合污而下，形成常见的风寒泻证型。主要以大便清稀夹有泡沫，臭气不甚，肠鸣腹痛为特征。拨火罐具有促进气血流畅，营卫运行，祛风散寒，止痛等作用。现代研究认为拨火罐疗法具有机械性刺激和温热效应等作用，罐内形成负压，使局部毛细血管充血，甚至破裂;红细胞破裂，随即产生一种组胺类物质，刺激有关器官，增强其功能活力，机械性刺激可通过皮肤感受器和血管感受器的反射途径传导至中枢神经系统，加强对身体各部分的调节和管理功能，使患部组织代谢旺盛，白细胞吞噬作用增强，促进局部血液循环，改善充血状态;也能加强新陈代谢，改变局部组织营养状态，增强局部耐受性及机体抵抗力，从而起到治疗疾病的作用[6]。天枢为大肠之募穴，中脘则是胃的募穴，两者均为治疗泄泻、腹痛、腹胀、肠鸣的重要穴位。本研究运用拔火罐的祛风散寒、行气止痛的功效，作用患儿的天枢、中脘两穴，从而起到祛除脾胃之风寒，调理脾胃运化的功能，促进中焦气血运行通畅，使脾胃升清降浊有度，脾健胃和，最终达到治疗小儿风寒泻的目的。本研究结果显示，拔火罐对小儿风寒泻有着较好的疗效，且操作简单，价格低廉。

在应用拔罐疗法治疗小儿风寒泻时应注意：拔罐前要先检查罐具，口部须光滑平整无破损;皮肤有溃疡破损处，有过敏，有血肿及大血管的部位，不宜拨罐，高热抽搐患儿不宜采用拨罐疗法;用火罐时应注意勿灼伤或烫伤皮肤，若烫伤或留罐时间太长而皮肤起水泡时，水泡勿需处理，仅敷以消毒纱布，防止擦破即可;水泡较大时，用消毒针将泡液放出，涂龙胆紫药水或用消毒纱布包敷，以防感染;根据不同部位选择不同口径的火罐;注意选择肌肉丰满，富有弹性，无凹凸不平处及毛发的部位，以防掉罐。操作时必须迅速，才能使罐拨紧，吸附有力。

参考文献

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篇（7）

中图分类号:R2-03 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)01-0051-03

Application of SELDI-TOF-MS in Clinical Diagnosis

LIU Chibo,LIANG Yong,CHEN Jinguang,PAN Chunqin,YAN Dongliang,WANG Haibao,ZHOU Kaiyu

(Taizhou Municipal Hospital,Taizhou 318000,Zhejiang,China)

Abstract:The technique of surface-enhanced laser desorption/inionation-time of flight-mass spectrometry(SELDI-TOF-MS) provides the most effective platform for research of proteomics. SELDI-TOF-MS, which combine the technologies of proteinchip with time of flight-mass spectra and integrate separation, purification, analysis of sample and realize rapid, high performance and high throughput detection, is an extremely important tool for diagnosis of disease at the molecular level.

Key words:SELDI-TOF-MS; proteomics; diagnosis

蛋白质组学(proteomics)技术是后基因组时代的一重要研究工具,在生命科学领域中发挥重要作用。蛋白质组学是通过对不同时间和空间发挥特定功能的蛋白质群体进行研究,阐明生物体全部蛋白质的表达和功能模式,包括鉴定蛋白质表达、存在方式(修饰形式)、结构、功能及相互作用方式等,从机体或细胞的蛋白质整体活动来揭示生命规律。而SELID蛋白质芯片技术是近几年发展起来的一个新的蛋白质组学技术。严格来说,SELDI技术是一种“比较”技术,也是在现有蛋白质组学技术中唯一在检测样本数量和每个样本中蛋白质数量两方面达到高通量的技术。在过去几年中,随着仪器性能和相关技术方法的改进和探索,应用SELDI蛋白质芯片技术对肿瘤标志蛋白的研究获得广泛和迅猛发展。2004年以来,该技术在美国已被列入人类蛋白质组计划主要推荐技术之一。我国已有20余个单位开展此项研究。以下对SELDI质谱技术的基本原理、优点及在临床诊断中的应用前景进行综述。

1 SELDI-TOF-MS原理

SELDI-TOF-MS技术结合了蛋白芯片和生物质谱技术,是继基因芯片之后出现的新一代生物芯片技术。该芯片设计的基本原理是:首先用生物或化学方法在载体表面制成点状芯池,再点入待检的生物样品,其中的蛋白分子通过其自身的生物或理化性质(亲水性、疏水性、金属络合及离子作用等)与芯片相结合,从而实现捕获、保留和纯化与之特异性结合的蛋白分子。接着用缓冲液洗脱未结合或非特异性结合的分子后再用激光脉冲进行轰击,即释放出靶点上的特异性蛋白分子。不同质荷比(m/z)的离子在电场中飞行的时间长短不一,分子量越大的离子在电场中飞行的时间越长,反之则越短。最后通过生物质谱(TOF-MS)即可绘制出一张质谱图。该图经分析软件处理后还可形成模拟谱图,用于更直观地显示样品中各种蛋白质的相对分子质量、含量及磷酸化位点等信息。蛋白质芯片根据表面物质的不同,可将其划分为化学型和生物型两类。化学型芯片通过化学作用结合样品中的蛋白质,并根据其作用原理的不同又可进一步细分为疏水性芯片、亲水性芯片、阳离子芯片、阴离子芯片和金属亲和芯片等类型;生物型芯片则是把生物活性分子,如抗体、酶、受体、DNA等结合到芯片表面,借助抗原-抗体、酶-底物、受体-配体、蛋白质-DNA等相互作用结合样品中的蛋白质。生物芯片特异性高,还可以进行蛋白质定量。

2 SELDI-TOF-MS蛋白质芯片技术的优点

相比传统蛋白质组技术,如二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)、电喷雾质谱(ESI-MS)、基质辅助激光解吸离子飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MS)技术,SELDI蛋白质芯片技术的优势在于:①可分析2D-PAGE无法分析的蛋白质,包括疏水性蛋白质,低分子量(

3 SELDI-TOF-MS技术在临床诊断中的应用

3.1 在肿瘤特异性标志物的筛选中的应用

3.1.1乳腺癌 Li等[1]用SELDI-TOF-MS技术及配套蛋白质芯片检测49例乳腺癌和37例非乳腺癌疾病患者的血清蛋白质指纹图谱,并运用SPSS 10.0软件判别分析处理数据和筛选标志物,建立了3个诊断模型。组合构建的诊断模型Ⅰ包括6个蛋白质峰,质荷比分别为8611、16827、25711、28931、25485和2437,鉴别乳腺癌和非乳腺癌疾病的敏感性为81.6%,特异性为78.4%。组合的诊断模型Ⅱ也包括6个蛋白质峰,其质荷比分别为4470、10854、19193、3883、2011和7470,鉴别Ⅰ期乳腺癌与非乳腺癌疾病的敏感性为80.0%,特异性为89.2%。组合的诊断模型Ⅲ包括5个蛋白质峰,其质荷比分别为2726、27014、2247、4477和19333,鉴别Ⅰ期与Ⅱ～Ⅳ期乳腺癌的敏感性为91.2%,特异性为93.3%。Ricolleaun[2]等采用SELDI-TOF-MS技术分析了30例非结节性无再发乳腺癌患者和30例发生转移性再发患者的病理标本,发现多达72个峰,其中两个被证明是泛肽和铁蛋白轻链(FLC)。进一步研究表明,细胞溶质的泛肽水平增高和(或)FLC的水平下降可以很好地预示乳腺癌。

3.1.2胃癌 Liang等[3]在胃癌方面检测了33例胃腺癌患者和31例健康者的血清蛋白质组,建立了质荷比分别为5910、5084、6640和8691的差异蛋白峰的胃癌特征性蛋白质波谱模型,用该模型检测的灵敏度为90.91%(30/33),特异性为93.55%(29/31),阳性预测值为93.75%(30/32)。Melle等[4]对74份包括胃癌组织、癌旁组织及正常胃上皮的冰冻切片进行分析,发现了一个在癌组织中明显下调的蛋白,免疫组化鉴定为胃蛋白酶(原)C(pepsinogen c)。高春芳等[5]研究发现胃癌患者与正常人在质荷比为1723～14048间有18种血清蛋白质含量有显著差异,其中质荷比为2786、2878、3170、13872、5257的5种蛋白质组成的生物标志物可将正常人与胃癌患者准确地分组,其敏感性与特异性均高于用CEA诊断胃癌。Qian等[6]利用 SELDI-TOF-MS技术及生物标记软件(BPS)发现了血清中16个有统计学意义的蛋白质峰,其中9个峰在胃癌患者中高表达。经过BPS分析,其中两个峰组成的肿瘤标记物模型在诊断的敏感性、特异性及准确性均高于目前临床上的血清标记物CEA、CA19-9和 CA72-4,尤其研究中的所有I/II期胃癌患者均被正确识别,但该诊断模型的临床意义仍需大规模的研究来验证。刘池波等[7]利用SELDI技术发现胃癌患者中一簇质荷比在11.1～11.9KD的蛋白峰明显高于健康者,经蛋白质组学技术鉴定该簇蛋白为血清淀粉样蛋白A,可用于胃癌患者的早期诊断、疗效观察。

3.1.3 前列腺癌 Pant等[8]使用SELDI-TOF-MS技术。对83例前列腺癌 (PCA)患者和95例健康人血清标本进行了检测比较。在PCA患者血清中有4种蛋白表达水平升高,8种蛋白表达水平降低,出现了18个潜在的生物标记。选择其中8个蛋白标记通过建立的五层决策树分类系统鉴别诊断PCA和健康人,特异性为92.6%,敏感性为96.4%。Adamt等[9]为了寻找PCA特异蛋白标记物,设定了3组研究对象(PCA患者167例,良性前列腺增生患者77例,年龄匹配健康男性82例),使用SELDI-TOF-MS进行血清检测,在PCA患者中发现9个蛋白质峰与正常人及前列腺增生患者不同。以检测到的9个蛋白质峰为分析依据,结果肿瘤组检测敏感性为83%,对照组特异性为97%,对试验组的阳性预测值为96%,合并试验组分析(PCA和非癌组)的阳性预测值为9l%。研究者认为,SELDI-TOF-MS和五层决策树分类系统对于PCA的早期诊断是一种高准确性和创新性的方法。

3.1.4肝癌 Wang[10]等将106份血清样本(包括52例肝细胞癌患者、22例肝硬化患者和32例健康志愿受试者血清)随机分成两组。训练组包括35例肝细胞癌患者、14例肝硬化患者和。21例健康受试者血清,用以建立人工神经网络(ANN)模型;试验组包括17例肝细胞癌患者、8例肝硬化患者和11例健康受试者血清。采用SELDI-TOF-MS技术对训练组56例样本(35例肝细胞癌患者、21例健康受试者血清)分析后获得241个蛋白质峰,其中21个峰用于肝细胞癌和正常对照比较(P

3.2在男性不育相关领域疾病研究方面的应用

杨欢等[11]利用H4、SAX2等芯片鉴定出几个在少精症患者异的生物标志物,如在H4芯片上,少精症患者精浆与生育男性精浆蛋白质图谱比较,有1处蛋白质峰明显增高,其相对分子质量为11507.4,有1处蛋白质峰明显降低,其相对分子质量为11022.9,在SAX2蛋白质芯片上,少精症患者精浆与生育男性精浆蛋白质图谱相比有1处蛋白质峰明显增高,其相对分子质量为16751.6。由此,可根据患者精浆中的差异蛋白含量可来帮助鉴定是否患有少症。白洁等[12]利用CM10芯片通过无症组与正常组比较有28种蛋白质表达存在差异,差异的蛋白质中有24种含量低于正常组,其中4个M/Z在7 196.058、7 630.573、7 547.610和7 709.833的蛋白质差异极显著(P

3.3在膝骨性关节炎不同中医证型领域研究中的应用

王海宝[13]应用CM10蛋白芯片分析了30例肝肾亏虚型膝骨性关节炎患者、35例气滞血瘀型膝骨性关节炎患者血清和40例健康着血清的蛋白指纹图谱,获得的蛋白质谱采用Biomarker Wizard和Biomarker Pattern软件分析。结果发现肝肾亏虚型膝骨性关节炎患者与健康者血清蛋白质谱相比有18个显著差异蛋白质(P

4展 望

蛋白质芯片技术是近年来兴起的的一种蛋白质组学研究的新方法,以质谱分析替代传统的免疫诊断也是一种新出现的疾病诊断模式,以SELDI质谱蛋白质芯片技术为寻找疾病标志物建立了一个良好的技术平台,其快速、高通量、准确的特点已经被广泛的认同。随着这项技术逐渐推向临床,也发现这项技术尚待完善,如差异蛋白的在线鉴定问题;如图谱中的峰高和蛋白质浓度之间的关系并非都是线性的;不同的研究者,由于检测过程中诸多因素的控制不一,对同种疾病得到的具有区分作用的峰是有差异的。所以 SELDI-TOF-MS要全面应用于临床研究,还需要在标准化、定性等问题上深入研究,在今后的实践过程中还有很多的问题需要解决,但SELDI-TOF-MS技术必将成为快速诊断、发现并鉴定肿瘤标志物的有效手段。

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篇（8）

作为反映新世纪国际医学发展趋势的新生事物，循证医学在国内一经引入便引起了前所未有的关注，其与中医学的内在联系一直都是众多学者争论的焦点[3，4]。但抛开争论，循证医学作为一种科学的模式或者说一种科学的方法学引入中医临床，为中医现代化服务这一观点已经成为共识[5]。另一方面，在西医作为主流医学的当今社会，中医由于受诸多因素的影响，尚难以用客观、准确、可重复的实验数据说明其疗效，长期被拒于科学体系之外[6]。而循证医学作为一种新的临床思维理念淡化了基本原理的研究，仅对临床疗效作出客观的评价。这对于以疗效著称的中医无疑是一次被世人认可的机遇。

1 临床中医师的循证医学实践

循证医学实践的目的是解决临床问题，包括认识和预防疾病，提高诊断的准确性，应用有效的措施改善并提高患者生存质量，这些都与临床医生紧密相关。但由于受主、客观因素的影响和多方面条件的制约，中医师在临床实践中仍是依靠经验和推论来进行临床决策的。而各个医生对理论的理解和掌握不尽相同，各自师承和自己形成的经验不尽相同，因此，在临床实践中存在不少弊病[4]。我们在临床常可见到对同一个病人，不同医生的辨证或方药也不尽相同，治疗的效果也就不一样。这样既不利于患者疾病的诊疗，也不利于医生治疗水平的提高。循证医学实践为临床中医师解决上述问题提供了重要手段。

1.1 掌握循证医学知识，接受循证医学指导 循证医学要求临床医师在工作中不断提出问题并通过严格的检索挑选和评价文献来回答这些问题。因此，中医临床要实践循证医学，首要的条件是作为实践循证医学主体的临床中医师必须摒弃循证医学是西医的事，与中医无关的思想，自觉接受循证医学指导。一是认识循证医学的本质、意义、价值，提高实践循证医学的自觉性；二是熟悉循证医学的基本内容、基本精神和主要步骤；三是掌握实践循证医学的各种知识、技巧，特别是快速、有效地查询相关文献资料，正确阅读、评价医学文献的基本技能，提高实践循证医学的能力[7] 。

1.2 借助循证医学方法，寻找最佳中医证据 按循证医学的定义，临床循证实践应有科学依据，强调按证据办事，而证据是已有的研究结果。目前，中医学的证据有三类[8]。第一类是四大经典，尤其是《黄帝内经》和《伤寒杂病论》，基本上是现在中医学证据当中的最基本也是最重要证据。第二类是四大经典之外的医学著作。这部分证据内容广博，数量繁多，其证据水平也参差不齐。第三类证据是按照现代科学思维方式研究所得到的临床证据。这些文献所报道的证据，从古至今一直指导着中医临床工作，尤其是具有中医特色的病案医话，在更广大的范围内指导着中医临床。临床中医师在循证医学实践中应重视第三类证据的质量和运用，但不能否定和排斥前两种证据。随着中医循证医学体系的建立和研究方法学的改进，今后势必对于已有的中医古籍文献进行评价，以加入到更高级别证据当中去运用。

1.3 尊重患者自我意愿，完善临床诊疗决策 查询文献所获得的结果是所有研究对象的“平均效益”，而我们主管的患者并未在研究中，其特点可能不同于文献中的研究对象。因此，在将临床研究证据应用于具体患者时应结合具体情况进行综合考虑和相应调整[9]。

证据是循证医学的基石。遵循证据是循证医学的本质所在。循证医学在疾病的诊疗过程中主张，将现有最好的研究证据与医生的临床实践和患者的选择三者结合起来综合考虑，选择最佳的治疗方案，为每个具体的患者服务[10]。其核心思想就是谨慎、明确、明智地应用目前最佳医学证据对每个不同健康状况的人作出正确的医疗保健决策，进而对每个不同患者的健康问题提出更为完善合理的解决方案。这样才能体现中医的特点，因时、因地、因人制宜。

2 结 语

中医是中华民族优秀的文化瑰宝，它经历了几千年的发展，逐步形成完整的理论及精湛的医疗技术，在世界医学科学技术快速发展的今天，依然保持着强大的生命力，根本原因就在于中医来源于实践，具有确实可靠的临床疗效。临床中医师在工作中引入循证医学方法，逐步建立和完善中医特色的中医诊断、疗效、治疗方案评价体系，必将为中医临床实践注入新的活力。正如陈可冀院士所断言：“循证医学在中医药研究中广泛应用的时候，也是中医药真正走向世界的时候” [3] 。

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7 朱方争.临床医学生学习循证医学的作用.广西医科大学学报，2003，20（1）：6162

篇（9）

EvidenceBased Medicine and Influence on Point Selection and Prescription in Acupuncture and Moxibustion

Huang Jinbo,Jin Rui(Guangzhou University of TCM,Guangdong 510405)

[Abstract]　Purpose　To introduce basic principles and methods of evidencebased medicine.Methods　Point selection and prescription of acupuncture and moxibustion were used as samples to introduce basic principles and methods of evidencebased medicine and its effect on point selection and prescription of acupuncture and moxibustion.Results and Conclusion　Point selection and prescription of acupuncture and moxibustion must have reliable clinical medicinal evidence,and at the same time,combine clinical experience with knowledge of basical medicine to direct medical practice.

[Key words]　EvidenceBased Medicine;Point Combination;AcupunctureMoxibustion;Point Selection

循证医学(evidencebased medicine,EBM),又译为实证医学。其定义为:一种要求临床医生了解支持其临床实践的证据以及这些证据的可靠程度的医疗实践模式。循证医学强调应以临床证据为基础,而这一证据的取得完全依赖于以科学的方法对现有临床资料进行收集和分析以及在此基础上形成的系统性评述[1]。用通俗的话来解释就是,医生作出临床决策时不能单纯依靠个人的经验、权威的观点或仅从病理生理学、药理学等角度来推理,而是要从文献中寻找最有力的证据,并把这些证据用于具体病人的诊断、治疗和预后判断。所谓的证据就是指设计合理、测量准确、结论可靠、发表在医学专业杂志上的文献,包括研究病因、诊断、治疗及预后等方面的文章(随机双盲对照试验、荟萃分析及系统综述)。因此,循证医学也就是用临床流行病学的原理和方法分析评价临床医学文献,并用于指导日常临床医疗实践的过程。其特点是系统、全面而且有定量的概念。循证医学与传统医学有重要的区别,传统医学以个人经验为主,医生根据自己的实践经验、高年资医师的指导、教科书和医学期刊上零散的研究报告为依据来处理病人。这种实践的结果是:一些真正有效的疗法因不为公众所了解而长期未被临床采用,一些实际无效甚至有害的疗法因从理论上推断可能有效而在长期、广泛的使用。循证医学的实践既重视个人临床经验又强调采用现有的最好的研究依据,一位优秀的临床医生应该既具有丰富的临床经验,又能依据现有的最好的科学依据来指导临床,二者缺一不可[2]。近10年来,循证医学已日益引起国外学者的关注,并有专门的教科书出版,因特网上更有不少循证医学的网站提供教学材料。在针灸治疗学领域,治疗某种疾病往往有多种组穴配方,并且医者从各种角度都推论出它们“应该”有某种疗效,但是不经过严格的随机对照临床实验很难确定某个或某组穴位是否真正有临床效果。因此,本文拟以针灸临床治疗的选穴配方为例,简要介绍循证医学的基本原理和方法及其对针灸选穴配方的影响。

1　循证医学的基本原理和方法

检索文献,这是第一步,也就是寻找证据。根据单位的具体条件可采取光盘检索、上网检索或手工检索有关杂志。

分析文献,这是第二步,也就是评价证据的可靠性。找到了数篇某个或某组穴位治疗某种疾病的文章后,应当提出以下问题:

(1)病人是否为随机分组是实验设计的基本要求。如果不是随机而是任意分组的话,治疗效果的差别可能会受治疗措施以外的其它因素的影响。已有的资料表明,非随机分组实验得出的疗效往往大于随机分组实验得出的疗效,其可靠程度大为减弱。在医学史上有许多非随机分组试验认为有效的疗法不能被随机分组临床实验所证实的例子。

(2)病人计算方法是否正确。在研究发现,依从性不好的病人预后比依从性好的病人预后差。如果从某一组中排除了依从性不好的病人,则可能使该组疗效人为的提高。因此,病人一旦被随机分组,不管其是否接受了治疗,都应作为目标治疗人群分析,即包括分组后的所有病人来分析。

(3)病人的随访情况。好的文章应如实描述失访病人数、失访原因及其入选时的基础资料。你可以假设失访的病人全部无效、全部有效,然后重新计算各组的疗效,如果总的结果不变,则说明失访的病人数不算太多,结论可靠,否则结论不可靠。

(4)临床试验是否双盲试验。病人及研究者对新疗法的乐观或悲观态度使得在报告和判断疗效时发生偏差。所以最好采用双盲性,当然针灸的选穴配方与服用药物不同,很难做到严格意义上的双盲。

(5)各组的基础资料是否相似。如果样本不太大,单纯随机并不能保证各组的情况完全平衡。当发现影响疗效的指标在各组间差别过大时,可以根据统计学方法进行校正。如果校正后仍能得出相同的结果,则结论可靠。否则,结论不可靠。

(6)除观察的治疗方法外各组的其它治疗是否相同。各种一般或基础治疗都可能影响疗效,所以文章应注明各组的其它治疗情况。

(7)治疗效果有多大。除了解差别是否达到统计学显著性(即P

(8)治疗效果的精确性。这要看有效率或差值的95%可信区间,95%可信区间越小,结果越精确。如果文章未报告可信区间,可用标准误来计算或根据原始数据计算。如果差值95%可信区间的下限值仍有临床意义,则结果有临床价值。

(9)文章的研究结果能否用于某个病人。如果你的病人与文章中的病人入选标准相符,而且没有排除标准,则其结果适合您的病人。要特别注意对疗效有重要影响的指标是否与你的病人相同,如中风患者血液流变学、血脂等的改变。

(10)临床有意义的指标是否包括在临床转归分析内。对某些指标有效不等于临床有效。如治疗中风后遗症与对照组相比,治疗组某些血液流变学指标有改善(达到统计学上的显著性),并不能认为这种方法对中风后遗症有效,还应该说明这种方法对病人的神经功能缺损评分和日常生活指数有无影响,才能证明临床真正有效。

2　循证医学与针灸取穴

关于针灸的临床治疗,历代医著中载有大量的治疗方法,选穴配方各不相同,尤其是近年来随着针灸临床治疗的迅猛发展,针灸治疗病种的不断扩大,临床工作者在遵循古典医著针灸处方的基础上,结合个人的经验体会又创立了多种针灸方法和选穴配方。目前对于同一种疾病的治疗,在运用针刺疗法时,往往有多种的穴位选择,无论是单穴应用还是组穴配方,相关的文献报道往往丰富多彩,但作为临床医生却常常莫衷一是,不知该采用何种治疗方法,哪一种方法是真正临床有效的。所以作为临床针灸医生有必要认真学习和掌握循证医学的基本原理和方法,用来指导自己的临床实践,循证医学正是一种从医学研究文献中获取系统信息用来指导临床决策的科学的方法论。广州中医药大学博士生导师靳瑞教授积多年临床经验创立的靳三针疗法,其取穴简单,疗效确切而深受临床医生的欢迎并为广大患者所接受。三针处方均来源于临床实践,并且经过数十位博士、硕士长期的临床和动物实验研究,证明其有确切的疗效,如颞三针治疗中风后遗症,智三针治疗精神发育迟滞,脑三针治疗运动功能障碍,肩三针治疗肩周炎,鼻三针治疗过敏性鼻炎等。相关的研究均经过严格的实验设计,其成果见诸于有关文献,经得起理论和实践的检验,是值得临床推广应用的针灸处方。当然必须指出的是,循证医学强调临床医学的实践和诊疗,医护决策必须建立在医生优良的临床知识、经验、技能与从系统研究中获取的最佳的临床证据完善的综合基础上。在大力提倡生物心理社会医学模式的今天,临床医学的许多问题还很难用随机双盲对照试验取得“证据”。同时,注重治疗方案的个体化原则也是临床医疗实践的基本原则,因此循证医学不能排斥临床经验和基础医学知识,而是要把它们和最可靠的临床医学证据结合起来指导临床。

3　参考文献

篇（10）

    1.1牙齿与肾的关系

明·王肯堂《证治准绳》曰：“牙齿属肾，为骨之余，肾之标，骨之所终，髓之所养，固随天葵（是一种促进性腺发育成熟的物质）的来去而盛衰”。《黄帝内经·素问，上古天真论》曰：女子七岁，肾气盛，齿更发长，三七，肾气平均，故真牙生而长极。丈夫八岁，肾气实，发长齿更，三八，肾气平均，筋骨劲强，故真牙生而长极；四八，筋骨隆盛，肌肉满壮；五八，肾气衰，发堕齿槁；六八，阳气衰竭于上，面焦，发鬓颁白；七八，肝气衰，筋不能动，天癸竭，精少，肾藏衰，形体皆极；八八，则齿发去。

中医学认为：正常人的牙齿洁白、润泽且坚固，是肾气旺盛、津液充足的表现。因为肾主骨，生髓的生理功能，实际上是肾之精气，具有促进机体生长发育功能的一个重要组成部分。认为：肾藏精，肾精能够生髓，髓藏于骨腔之中，而髓养骨促进生长发育，因为肾精充足则骨髓生化有源，骨骼能得到充分滋养而坚固有力。若肾精虚少则骨髓化源不足，不能营养骨髓，则会出现骨骼脆弱无力。因此，肾-精-髓-骨组成一个系统，有着其内在联系。

因为牙齿属骨的一部分故有“齿为骨之余”之说，即然牙齿与骨同出一源，俨以牙齿也依赖于肾中精气所养，肾精充足，则牙齿坚固齐全。若精髓不足，则牙齿松动，或脱落。正如《杂病源流犀烛·口齿唇舌病源流》中说：“齿者，肾之标，骨之本也。”叶天士在《温热论》中也明确指出：“齿为肾之余，龈为胃之络”。

所以不论是在口腔的保健上还是人体生理的治疗上，都应重视养肾。如果肾精不足，骨髓空虚，骨骼失养，在小儿就会发育迟缓，骨软无力，出现五迟，五软。其中五迟便包括齿迟，即生牙过晚。在成人可因骨质疏松痿软，而见腰膝酸软甚至足痿不能行走，以及牙齿松动、容易脱落的情况。老年人因髓减骨枯还易发生牙齿骨折。

古语云：“百物养生，莫先固齿。”人的天生禀赋不同，牙齿亦然。因为与先天之精——肾精的充足与否密切相关。若先天不足者，即使很注重口腔卫生，各种牙齿疾病也可以发生，因为人体的整个生长、发育过程，均和肾中精气的盛衰存在着极其密切的内在联系，所以中医认为养肾精是护齿所必需的。因为牙齿是依赖于肾中精气所充养，若肾精充盛则骨髓生化有源，骨髓充足则骨骼得养，牙齿则坚固有力不易脱落，所以牙齿与肾以及骨骼有着密切的内在关系。

1.2阴阳平衡与口腔疾病

中医认为，口齿病因除与肾精的盛、衰有着密切关系外，还提出了人体阴阳平衡的理论。用中医学的阴阳学说来分析人体健康和疾病的矛盾，贯穿于中医阴阳理论体系的各个方面来说明人机体上的组织结构、生理功能、病理变化，并指导临床诊断和治疗。

这种阴阳平衡协调关系一旦受到破坏而失去平衡，便会产生疾病，所以阴阳平衡学是人体赖以生存的基础，是健康的标志，平衡的破坏意味着疾病的发生，因此，阴阳失调是疾病发生的基础。

口腔疾病的发生同样是由于口腔环境阴阳系统平衡受到破坏而失去平衡所导致的，在阴阳的属性中又分为正气与邪气。正气是指人体自身存在的东西，也可以说是人体对外环境的适应能力、抗邪能力及康复能力；邪气是指各种致病因素的总称。正常健康的人其正气与邪气是对称平衡的。

疾病的发生就是正邪斗争的过程。邪正斗争导致阴阳的失调，出现各种各样的病理变化，使疾病发生。比如，在口腔的生态环境中存在着许许多多的细菌（有益菌和致病菌），在这些微生物之间同样也存在着正与邪之间的斗争。在致病菌（邪气）迅速生长、繁殖，有益菌（正气）明显减少的情况下，就出现“邪”盛、“正”弱的局面，使得口腔阴阳平衡系统失调，促使口腔各种疾病的发生。这与现代口腔医学的口腔生态学平衡理论是相吻合的。

从现代口腔医学的口腔生态学的理解与解释，就是口腔组织器官与微生物之间相互作用的生理平衡和病理的失调之间关系，从口腔生态系统来说是微生物和宿主（口腔）之间存在着复杂食物共生和拮抗关系。当口腔生态处于平衡状态时，宿主（口腔）表现为健康无病的状态，当平衡失调时，宿主就表现出各种各样的疾病。所以维护口腔阴阳生态系平衡是预防口腔疾病有效方法。

①牙本质过敏

牙本质过敏，中医学上也称齿滕，引起牙本质过敏症是由于口腔牙体的阴阳平衡系统受到各种条件因素影响，破坏了阴阳系统中的生态平衡导致牙本质过敏。现代医学认为牙本质发病原因是由于：工作环境（酸作业等）影响使牙釉磨损，使牙神经暴露等原因，使一个完整、健康的牙体某些部位受到破坏，使牙本质神经暴露，当受到温度、化学、机械等刺激，引起难以忍受的疼痛。中医学说解释认为口腔“阴阳”环境这种“邪”、“正”相搏中由于“正气”不足（牙齿磨损而神经暴露），受到强盛的“邪气”（温度、化学、机械等）侵犯。在这种“正”与“邪”的斗争中，由于“正”不敌“邪”，则引起牙齿疼痛（牙齿过敏）。

    ②龋病

现代医学认为龋病、牙周病的产生是因为环境因素的改变，牙菌斑生态平衡失调所致。也就是说在口腔生态环境中主要致龋菌——变形链球菌、乳杆菌等占优势，是导致龋病发生的重要原因之一。龋齿，历代医学名称繁多，如虫蚀牙齿、虫齿、齿龋、蛀牙、烂牙等，都是龋齿的别名。隋·巢元方《诸病源侯论》认为龋病是虫食于牙，牙根有孔，虫居其间，亦令齿痛，食一牙尽，又度食余齿。所谓的“虫”是因限于当时条件，把龋蚀牙体的细菌称为牙虫。

从中医阴阳学说的平衡系统来说就是在口腔阴阳系统的环境里，在“正”与“邪”的相博中，致龋菌（邪气）——变链菌等，战胜有益菌（正气），在这“邪”与“正”的斗争中由于“邪气”战胜“正气”致使龋病的发生。《黄帝内经》理论认为，各种致病因素作用于人体后是否发病主要取决于人体“正气”的强弱和外界致病因素两个方面，也就是说要看“正”与“邪”双方力量的对比。如果正气旺盛邪气就不会侵入，即使侵入人体也不会使人致病；而在口腔环境中当“正气”相对虚弱，不足以抵抗“邪气”，邪气就会乘虚而入，便发生各种口腔疾病。

2中医学预防口齿疾病的理论

中医学口腔保健和预防口齿疾病的理论强调整体观念和辩证论治，因为中医学非常重视人体本身的统一性、完整性及与自然界的相互关系。认为人体是一个有机整体，构成人体的各个组成部分之间在结构上是不可分割的，在功能上是相互协调、相互为用的，在病理上是相互影响的。

由于中西医学形成的理论体系不同，对疾病的认识也各有不同的理论。但他们也有共同之处，即邪、正之间的斗争是导致疾病发生的根源，即所谓“致病之谓邪”。比如，现代各种预防疾病疫苗的发明和使用就是通过人体免疫机制而起作用的，也就是加强这种“正气”就增加了人体的抗病能力。

2.1治未病不治已病

《黄帝内经·素问·四气调神大论》指出：“圣人不治已病治未病，不治已乱治未乱”，此之谓也。夫病巳成而后药之，乱已成而后治之，譬犹渴而穿井，斗而铸锥，不亦晚乎！

所谓“未病”、“末乱”，就是指疾病前状态或某种疾病的征兆，是从质变为疾病的量变积累过程，也就是说，是处于亚健康状态（介于健康与疾病之间状态，也可以说是第二状态或灰色状态）。亚健康状态的特点是不断的动态变化发展，既可向健康状态转变也可向疾病状态转化，向哪方面转化取决于我们的保健措施。

“治未病”的核心意义就是要求重视疾病的预防，强调在“未病”、在疾病发生前采取积极、有效的预防保健措施以防患于未然。因此可以说“治未病”是中医临床的重要指导思想，也是治疗亚健康状态的理念，两者相当契合。健康是人类与自然环境及社会之间的一种动态平衡，而亚健康和疾病则是人体的阴阳失衡的结果。

2.2整体观念

中医学说的整体观念包括两方面的内容：

①人体是一个有机的整体，构成人体的各个组成部分之间，如气、血、津液、脏腑、经络等组织器官，在结构上是不可分割的，在生理功能活动中是相互协调为用的，在病理变化中是相互影响的。

②人与自然之间也是一个整体，自然间的变化（如四时气候、昼夜晨昏、地区方域等）对于人体的生理、病理均有一定的影响。因此，中医治病时强调“因人、因时、因地制宜”。

2.3辩证论治

辨证论治是中医认识疾病和治疗疾病的基本原则，是中医学对疾病的一种特殊的研究和处理方法。又称辨证施治，包括辨证和论治两个过程，但其指导思想是阴阳平衡观念。明确指出人体本身就是阴阳的对立统一，人的生命活动过程，就是人体阴阳对立双方在矛盾运动中不断取得平衡的过程。在正常情况下，人体的阴阳两方面是相对平衡的。一旦人体的阴阳关系失调，正常的平衡状态被破坏，人体就会发生疾病。

中医学认为，任何疾病的发生、发展过程，都是致病因素作用于人体，而致机体阴阳偏盛偏衰、脏腑经络功能失调的结果。因而，药物防病治病的基本作用，不外乎祛邪去因，扶正固本，协调脏腑经络功能，从而纠正机体阴阳偏盛偏衰，使其恢复阴平阳秘。药物之所以能够针对病情发挥上述基本作用，是由于各种药物各自具有若干特性和作用，前人也称之为药物的偏性，意思是说以药物的偏性纠正疾病所表现的阴阳偏盛或偏衰。但古人未能对药物作用的物质基础进行深人的探究，以药物的偏性来解释药物作用的基本原理，只能对药物作用进行高度概括。

3讨论与思考

祖国医学是我们祖先的发明和创造，不仅是中华传统遗产，也是代表中华民族拥有“五千年”的悠久历史，是我们祖先留给我们后代巨大无形的宝库。我国口腔医学的发展与中医学一样具有悠久的历史，中医口腔科是祖国医学的一个重要组成部分。中医学由于受历史条件限制，一些理论尚不清晰其科学内涵，还有待进一步深入研究。我们都是从事牙膏生产和应用科学研究的专业人员，肩负着生产、科研和提高产品质量的重任，所以我们必须对中药牙膏所采用的中药应有所了解。尽管目前中药牙膏的品质在不断提高，但还存在诸多不足，很多工作还需要我们进一步深入地去研究。

3.1改进落后的传统提取工艺

改变黑、大、粗的煎煮提取工艺。因为这种中药煎煮法，质量低，粗糙，均一性和疗效差。在提取过程中可能因温度及溶液中复杂的化学成分环境使溶液发生物质间的络合、水解、氧化、还原等反应，也可能生成溶液中原来没有的某些新物质，从而影响药物的药效，另一方面严重影响牙膏的口味、香气、色泽和稳定性。

3.2标准化中药提取

对所选择的中药应研究确定其有效部位和有效成分再进行提取，达到“去其槽粕，取其精华”，使其化学性能、药理作用都有明确表达。避免过去中药牙膏的药物用量采取“一锅端”，如散弹打鸟，其药物作用成分、机制等细节无法言明。

篇（11）

[主题词] 针灸原理;基因表达;克隆,分子;聚合酶链反应ComparisonamongThreeDifferentialExpressionGeneCloningMethodsZhangXue

chao,SunGuojie(HubeiCollegeofTCM,Wuhan430061)[Abstract] Theprinciple,application,advantagesanddisadvantagesofthecommonlyusedthreecloninggenemethods,i.e.,differentialdisplayreversetranscriptasePCR(DDRTPCR),suppressionsubtractivehybridization(SSH)andRNAarbitrarilyp

rimedPCR(RAPPCR)arebrieflyintroductedinordertoclonesignificantgenesrapidly,effectivelya

ndaccurately.Thesemethodsprovideeffectivemolecularbiologictoolsfordifferent

ialexpressionofgeneandmolecularcloningofgeneintreatmentofdiseaseswithtraditional

Chinesemedicineandacupuncturemoxibustion.

[Keywords]AcupMoxMechanism;GeneExpression;Cloning,Molecular;PolymeraseChainReaction

高等生物大约有100000个不同的基因,但在生物体内任一细胞中只有15%的基因得以表达。而这大约15000个基因的表达是按时间和空间顺序有序地进行着,这种表达方式即为基因的差别表达(differentialexpression)[1]。生物体表现出各种各样的特性,主要是其基因表达的差异引起的。基因差异表达的变化有两种,即新出现的基因表达与表达量差异的基因表达。由于基因表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制,通过比较同一类细胞在不同生理状态下或在不同生长发育阶段的基因表达差异,可为分析生命活动过程提供重要信息。当前,人类基因组研究的重心正在由“结构”向“功能”转移,一个以基因组功能研究为主要内容的所谓“后基因组时代”(postgenomics),即功能基因组(functionalgenomics)时代即将到来,这就决定了寻找差异表达基因成为分子生物学的研究热点之一。

目前已有针灸科研工作者从分子生物学水平探讨针灸治疗各种疾病的可能机理。有实验[2]报道针刺翳风等穴位面神经组织中NT3及TrKCmRNA表达增加;针刺后癫痫大鼠海马内nNOSmRNA和iNOSmRNA增加[3];针刺可调节CCK8mRNA、THmRNA、SOMmRNA、cfos\cjunmRNA、CGRPmRNA的增减[4]。为适应当前医学的发展,为满足针灸科研工作者分子生物学研究的需要,本文对差异显示PCR、抑制性消减杂交及RNA任意引物PCR三种常用的差异基因筛选法,分别从其基本原理、过程、应用范围及优缺点等作一个简介。

1 差异显示PCR(differentialdisplayreversetranscriptasePCR,DDRTPCR)

该方法是自1992年由Liang和Pardee建立起来的[1],后经多年改进,目前已被广泛的使用。它已较成功地用于胚胎发生[5]、脑发育[6]、生长因子激活与抑制、信号传导[7]、癌症[8]等有关的基因的鉴定与克隆。其主要原理是:利用mRNAs结尾处的多聚腺苷酸[poly(A)]结构,在其3｀端设计如5｀T11CA排列样的锚定引物,该引物可与mRNAs总数的十二分之一[即poly(A)前面2个碱基为TG的mRNA]结合,从而使这部分基因得到逆转录;而一套(即T11MN,N代表任意碱基,M为除T外的其他三种碱基,共12条)引物可将全部mRNA得到扩增。在其5｀端再设计一些任意碱基序列的引物,就可使不同长度的基因得到扩增。

DDRTPCR包括3个基本步骤:①用一套锚定引物反转录样本mRNA为cDNA;

②用一套随机图1DDRT-PCR过程引物和锚定引物扩增cDNA;③电泳分离产生PCR片段。由图1可知,条带2、5分别为不同组织A、B所特有。将差别表达条带进行回收、鉴定分析,即可获得差异表达的目的基因。

DDRTPCR具有简便、快捷、所需起始材料少;由于PCR技术的应用,使得低丰度mRNA的筛选成为可能;可同时对多个样本进行比较;可检测基因的上游调节和下游调节。但其缺点是假阳性条带太多,有时甚至高达85%[9],而且重复性差;获得的差异片段较短,因而在Northernblot检测时往往得不到杂交信号。

2 抑制性消减杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)

消减杂交最早由Lamar和Palmer于1984年报道[10],后经多年的改进,它已发展为许多基因克隆方法的基础,SSH就是其中之一[11]。该方法运用杂交动力学原理,即丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交速度快于丰度低的单链cDNA,并同时利用链内退火优先于链间退火的特性,从而选择性地抑制了非目的片段的扩增。其基本过程(见图2)为将tester(样本)mRNA和driver(参照)mRNA分别逆转录为cDNA,用4碱基识别酶(RsaI)酶切两种cDNA产生平端片段;testercDNA分别接上adapter(接头)1及adapter2并与过量的经RsaI酶消化的driver样本杂交。引物设计在adapter上,这样仅使具有差异表达的片段成为PCR的模板,同时接头上含有启动子序列及限制性内切酶识别位点,为以后连接克隆载体和测序提供方便。经过重复消减杂交以便减少非特异性片段的扩增,使得差异表达的目的基因片段得到大量富集。

该方法具有高度的灵敏性、假阳性率低、分离的差异条带多。然而其仅能比较成对RNA群体间差异表达的基因,起始材料要求较多、对小片段缺失的样本无法检出,由于稀有mRNA不适合杂交动力学而使这部分基因漏掉,通过使用driver序列和tester序列彻底杂交的扣除方法可以避免非差异表达的序列,但副作用是使那些不按“全或无”模式表达的基因之间的明显差异变化变得模糊,并还存在adapter与cDN段的连接效率问题等。但SSH仍不失是目前较有效的克隆目的基因的方法之一[12,13]。

3 RNA任意引物PCR(RNAarbitrarilyprimedPCR,RAPPCR)

RAPPCR方法与DDRTPCR同时报道[14],其基本原理也较为一致。但其具体使用方法与DDRTPCR不同。首先,用任意引物在RNA模板和其配对最好的位点进行反转录合成第一链cDNA或者在反转录的第一步即加入5｀随机引物与3｀锚定引物,如果RNA具有6～8个碱基与该5｀引物的3｀端相匹配,则该随机引物同样能引导cDNA第一链的合成。这样,通过两种引物的反转录即可以研究所有RNA,包括开放阅读框(openreadingframe,ORF)。第二链是在任意引物所找到的最佳配对位点起始合成。在扩增序列引物和模板配对比较差的一端,可以由极好配对的另一端得到补偿。以上的结果是收集了在3｀和5｀端侧翼有和任意引物相同的序列(互补的序列)的基因片段。这些片段可作为模板进行谨性的PCR扩增,最终得到与基因组DNA指纹(DNAfingerprinting)相似的指纹。因此该方法也称为RNA指纹技术(RNAfingerprintingtechnique)。凝胶电泳可以显示全部PCR产物,再从中回收差异表达的基因片段,进行克隆、测序及功能分析。其基本步骤如图3。图中条带A、C为组织1或2特有的,B为不同组织表达量差异的条带。图3RAP-PCR基本过程

该技术经过多年的应用和改进,利用此方法有人已成功的寻找到一种新的神经膜蛋白基因[15]、并在某些疾病相关基因[16]、信号传导相关的调节基因等方面得到广泛的应用[17～19]。有实验表明,RAPPCR在一定的反应条件下,重复性相当好,可达90%。RNA的浓度、DNA的污染等均对结果无明显影响;组间条带的亮度差异在20%以上即可定为基因的差异表达[20]。与DDRTPCR、SSH比较,该方法有其独特的优点:首先,RAPPCR可以同时比较2个以上的RNA样本,并且来自各式各样的调控种类的基因能直接克隆。因此,对于任何被观察到的差异片段,能分析许多因素的影响。其次,以PCR为基础的RNA指纹分析方法另一个优点是可以在几天内产生结果,而不像DDRTPCR及SSH那样需要许多步骤,花几周时间。再次,由于长序列随机引物的应用大大降低了假阳性条带的出现。另外,RAPPCR灵敏高、起需起始材料少。尽管RAPPCR具有诸多的优点,但该方法需要较高的变性温度和较低的离子强度;并且随机引物并非选择性扩增的专一目标,有可能正好在某一类基因的保守区或分散的基因重复序列区,这样有可能只扩增这一类基因。象其他方法一样,RAPPCR电泳产物的回

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